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IN-WB001 Invent ® RIPA裂解液
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RIPA 提蛋白真的靠谱吗？文献指出存在这些误区......
4710 人阅读发布时间：2021-05-26 17:19
RIPA 提蛋白靠谱吗？这些问题你有遇到过吗?
RIPA 裂解液用于样品总蛋白提取已经有三十多年的时间，但是他到底适不适合你的下游实验，这个事你考虑过吗？比如 RIPA 提到的蛋白图谱是否完整?和其他方法对比提取的蛋白有哪些差异？使用时有没有潜在问题？一句话：RIPA 到底靠不靠谱？
最近看到几篇文章里是这么说的：
(Zapata et al., (1998). J Biol Chem 1998, 273:6916-6920.)
研究方法：
p24, p20 存在于 RIPA 提取的蛋白中，但 Laemmli 裂解液提取的蛋白中却不存在。证明了 RIPA buffer 提取蛋白时会人工激活 caspases-3 and caspase-7.
划重点：细胞凋亡研究时要慎用 RIPA
(Deseau et al., (1987). J Cellular Biochem 1987, 35:113-128).
研究方法：
1. 培养的结肠癌细胞分别使用 RIPA 和 NP-40 提取
2. 用特异性单克隆抗体进行免疫共沉淀
3. 使用同样量 pp60-src 沉淀蛋白进行激酶检测
主要发现：
(Courtesy of G. Szanda,NIH/NIAAA/LPS)
研究方法：
Mukhopadhyay, C. et al. (2016). PNAS. 5: 8228-8237.
研究方法：
1．野生型和突变型乳腺上皮细胞通过 RIPA 裂解液裂解，通过离心获取 RIPA 可溶性和不可溶性组份
2.RIPA 不可溶性组份用 SDS-PAGE 样品缓冲液溶解，使用多种抗体进行验证
主要发现：
1. RIPA 不可溶性组份中有明显的蛋白丢失情况
2. 野生型和突变型样品均有丢失蛋白，包括磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白（YP-416 S-crc）
划重点：在某些蛋白质磷酸化研究中慎用 RIPA
Lamber CM Ngoka (2008). Proteome Science. 6:1 (1).
研究方法：
划重点：细胞外基质研究时慎用 RIPA
BioTechniques 61:272-275 (December 2016)
研究方法：
What？看完一脸懵 X 吗？用了这么久的 RIPA 居然有这么多慎用，这也太不靠谱了，那该怎么办？
如果正在做以上实验研究遇到问题，那么务必要使用不同提取蛋白的方法来验证结果！有没有一种方法能够解决 RIPA 蛋白提取中的问题呢？
美国 Invent 公司的离心管柱专利技术，是蛋白提取的革命性新技术，只需加入裂解液，过柱离心，不产生不可溶组份，1 分钟轻松解决蛋白丢失问题。
RIPA 裂解液用于样品总蛋白提取已经有三十多年的时间，但是他到底适不适合你的下游实验，这个事你考虑过吗？比如 RIPA 提到的蛋白图谱是否完整?和其他方法对比提取的蛋白有哪些差异？使用时有没有潜在问题？一句话：RIPA 到底靠不靠谱？
最近看到几篇文章里是这么说的：
- PART 1
(Zapata et al., (1998). J Biol Chem 1998, 273:6916-6920.)
研究方法：
- 分别使用 RIPA 和 2% SDS + 超声提取未激活 T 淋巴细胞（Lanes 1 和 5）和激活的 T 淋巴细胞（Lanes 2-4 和 6-8）裂解细胞提取总蛋白
- WB 进行 caspase-3, Caspase-7, parp and GD4 活性检测
p24, p20 存在于 RIPA 提取的蛋白中，但 Laemmli 裂解液提取的蛋白中却不存在。证明了 RIPA buffer 提取蛋白时会人工激活 caspases-3 and caspase-7.
划重点：细胞凋亡研究时要慎用 RIPA
- PART 2
(Deseau et al., (1987). J Cellular Biochem 1987, 35:113-128).
研究方法：
1. 培养的结肠癌细胞分别使用 RIPA 和 NP-40 提取
2. 用特异性单克隆抗体进行免疫共沉淀
3. 使用同样量 pp60-src 沉淀蛋白进行激酶检测
主要发现：
- 使用 RIPA 提取蛋白，激酶活性比 NP-40 提取高了七倍
- RIPA buffer 人工增加激酶活性
- PART 3
(Courtesy of G. Szanda,NIH/NIAAA/LPS)
研究方法：
- 研究使用化学诱导和无诱导的人细胞系，总蛋白分别使用 RIPA 和柱式法蛋白提取
- 蛋白通过 SDS-PAGE 分离，进行 WB 检测磷酸化蛋白的对比
- NT = 细胞没有通过化学处理激活（基线水平），T = 细胞通过化学激活处理。化学激活后，磷酸化蛋白（P）预期应比基线水平（NT）增加，非磷酸化蛋白（np）减少。
- 通过 actin 条带强度可以证明蛋白样品是等量上样
- STATE3 在两种提取方法中显示了同样的趋势
- P56 在两种提取方法中却显示明显的不同
- 离心管柱法提取蛋白获得了预期的结果，但是 RIPA 获得了完全相反的结果
Mukhopadhyay, C. et al. (2016). PNAS. 5: 8228-8237.
研究方法：
1．野生型和突变型乳腺上皮细胞通过 RIPA 裂解液裂解，通过离心获取 RIPA 可溶性和不可溶性组份
2.RIPA 不可溶性组份用 SDS-PAGE 样品缓冲液溶解，使用多种抗体进行验证
主要发现：
1. RIPA 不可溶性组份中有明显的蛋白丢失情况
2. 野生型和突变型样品均有丢失蛋白，包括磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白（YP-416 S-crc）
划重点：在某些蛋白质磷酸化研究中慎用 RIPA
- PART4
Lamber CM Ngoka (2008). Proteome Science. 6:1 (1).
研究方法：
- 使用 RIPA buffer 提取乳腺癌组织中总蛋白
- RIPA 方法提取丢弃的不可溶性组份通过尿素裂解液再次提取蛋白
- 通过质谱分析两部分蛋白质图谱
- RIPA buffer 提取后不可溶性组份中含有很多种蛋白
- 几乎所有的细胞外基质蛋白都存在于不溶性组分中
- 不溶性组分中蛋白质的分子量平均高出 60%
划重点：细胞外基质研究时慎用 RIPA
- PART 6
BioTechniques 61:272-275 (December 2016)
研究方法：
- 小鼠组织样品分别使用离心管柱法和 RIPA buffer 提取总蛋白
- RIPA 提取后不可溶组份进一步使用离心管柱法进行提取
- 提取后的蛋白通过 SDS-PAGE 分离，考染进行对比
- RIPA 不可溶组份扔可以提取出蛋白，分子量从小于 20KD 到大于 120KD 范围，证明 RIPA 提蛋白有丢失
- 最明显的区域是低分子量蛋白
- 蛋白丢失是具有选择性，且不成比例的
- 不同的样品间蛋白丢失的图谱是不同的
What？看完一脸懵 X 吗？用了这么久的 RIPA 居然有这么多慎用，这也太不靠谱了，那该怎么办？
如果正在做以上实验研究遇到问题，那么务必要使用不同提取蛋白的方法来验证结果！有没有一种方法能够解决 RIPA 蛋白提取中的问题呢？
美国 Invent 公司的离心管柱专利技术，是蛋白提取的革命性新技术，只需加入裂解液，过柱离心，不产生不可溶组份，1 分钟轻松解决蛋白丢失问题。