科研单身狗，七夕我来拯救你的磷酸化蛋白WB！

 

     别人都在过七夕，科研狗+单身狗=？？？

在这个日子里，我能想到最浪漫的事

就是---WB别再虐我了！

哈哈哈哈，下面送上宝典！

       蛋白质磷酸化是最重要的蛋白质翻译后修饰之一，控制着包括代谢，转录和翻译调节，蛋白质降解，细胞信号传导和通讯，增殖，分化和细胞存活等许多过程。

      Western blot是检测和定量磷酸化蛋白质的最常见方法。磷酸化蛋白WB与常规蛋白WB其实没有真正的差异，但是由于磷酸化蛋白的丰度较低，因此通过WB检测时经常会遇到困难。所以总结了以下小技巧给大家作为参考。

一旦细胞裂解，蛋白酶和磷酸酶会立即释放到细胞裂解物中。 磷酸酶的周转率非常快， 磷酸化蛋白质可以在几毫秒内去磷酸化。 为了防止蛋白质被降解和去磷酸化，蛋白酶和磷酸酶抑制剂须在使用前加入到细胞裂解缓冲液中，细胞裂解物必须保持在冰上。 在测定蛋白浓度后，应尽快将细胞裂解物与SDS-PAGE上样缓冲液混合（上样缓冲液也可抑制磷酸酶活性）。

       根据细胞生长条件和细胞特定周期阶段，磷酸化蛋白可能仅占细胞裂解物中总蛋白质的一小部分。当未检测到磷酸化蛋白质时，应考虑样品中磷酸化蛋白是否存在或者低于WB检测的量。

RIPA裂解液是蛋白样品制备最常用的细胞裂解液，然而，RIPA裂解液在蛋白质提取中会产生两个不同的组分，即RIPA可溶性和RIPA不溶性组分。已有很多例证显示许多蛋白质在不溶性部分中丢失。非总蛋白的提取也会影响磷酸化蛋白质的检测和定量。

 案例：使用RIPA裂解小鼠MEC细胞时，磷酸化的EGFR仅在RIPA可溶性组分中检测到。然而，磷酸化的c-Src在RIPA可溶性和RIPA不溶组分中都可检测到，甚至WT样品（下图）在RIPA不溶组分中的信号中更强。这表明如果仅使用RIPA可溶性组分进行实验，那么磷酸化c-Src蛋白会被丢失在不可溶组分中，做定量研究时，c-Src蛋白磷酸化水平就会被低估。

 牛奶中含有的酪蛋白是一种丰富的磷蛋白，当使用牛奶封闭膜时，常会引起高背景。推荐使用其他的封闭溶液，如牛血清白蛋白或其他非牛奶配方封闭剂如Minute ^TM WB Blocking Solution（Cat＃WA-008，Invent Biotechnologies）。

 磷酸化是细胞信号转导和蛋白质磷酸化状态动态变化的关键反应。 一些蛋白质仅在某些条件下才进行磷酸化，例如化学或生物刺激。所以需要优化条件以了解蛋白质发生磷酸化的节点。 例如需要在收获前刺激细胞，尝试不同的刺激条件和不同时间，以找到磷酸化何时达到最高水平。

实验要设置合适的阳性对照，且检测时总蛋白和内参对照都要做。一种简单的检测总蛋白质与磷酸化蛋白质的方法是可以使用荧光二抗，可以轻松地检测和确定蛋白质的磷酸化状态。

在这特殊的日子里，我们还为大家准备了“葵花宝典”作为科研单身狗的小礼品，记得带走哈！