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IN-WB001 Invent ® RIPA裂解液
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WB 样品制备干货
3754 人阅读发布时间：2019-09-02 09:38
Western Blot 已经走入千家万室，成为实验室的看家实验。据悉有小伙伴 8 天能撸 12 次 WB，但是结果总是不尽人意。WB 能否十分成功，大概一分靠操作，一分靠试剂，一分靠运气，七分靠样品质量！
样品的质量直接决定了 WB 的结果，蛋白提取是 WB 成功的第一步，所以 WB 样品制备很重要！
为此 Invent 柱式法蛋白提取专家为大家总结了 WB 样品制备的方法及注意事项，请搬好小板凳仔细看！
样品制备前
1 资料查找
首先要确定自己的样品种类及数量，WB 为了要验证什么结论？目标蛋白的表达量如何？蛋白定位在哪里？目标蛋白是否有特殊的性质？通过这些内容来确定自己需要制备的是什么蛋白！
例如：
*研究小鼠肝脏组织，目标蛋白表达量很高，想证明这个已知蛋白的表达，那就进行组织样品总蛋白提取即可。（总蛋白如何提取点这里）
*研究 293 细胞，目标蛋白在胞质和胞核内均有表达，想验证目标蛋白在两个不同组分中表达量的对比，那就需要进行细胞样品的胞质胞核组分分离，分别用胞质和胞核蛋白组分检测。（胞质胞核如何分离点这里）
*研究 Hela 细胞，目标蛋白在内质网上，蛋白表达量较低，用总蛋白验证检测条带较弱，需要进行细胞样品内质网蛋白富集后再检测，提高检出效率。（细胞器如何分离点这里）
*研究小鼠心肌组织，进行蛋白定位或研究蛋白转运过程，那就需要进行细胞组分分离，分别检测细胞核，细胞浆，细胞器，细胞膜，内体等组分。（如何进行细胞组分分离点这里）
2 选择合适的提取方法
明确好自己需要制备什么蛋白后，选择相应的方法进行提取。选择方法的原则是保证提取的蛋白图谱正确完整，且比例正确的前提下，达成最大限度的提取！部分核蛋白，细胞器蛋白，膜蛋白属于不可溶性蛋白很难提取，以及难以处理的样品例如皮肤，骨骼，血管，肌腱，肠，肌肉，昆虫组织，建议大家使用专用试剂盒进行蛋白提取，不需要花时间摸索提取条件，即可得到满意结果。（特殊样品如何提取总蛋白点这里）
样品制备时
1 样品前处理
细胞样品在提取前需要使用 PBS 清洗两遍，以减少培养基对样品的干扰，悬浮细胞可 500Xg 低速离心后收集进行蛋白提取。贴壁细胞可在培养器皿中直接进行蛋白提取。蛋白提取前建议进行细胞计数（细胞计数方法点这里）以确定提取中添加裂解液的比例，得到最佳提取效率。
组织样品推荐的取样顺序：最先取消化系统相关的组织（如胃、大小肠、肝脏、胰腺等）和富含巨噬细胞的组织（如肺)，然后取生殖相关的组织（如卵巢、子宫、睾丸等），最后取心、脾、肾、脑等器官。取下的组织如不马上使用，需冻存在液氮或-80 度冰箱里。组织样品在提取前也需要用 PBS 清洗，一些含血量丰富的组织，建议使用红细胞裂解液（Invent Cat# WA-007）去除红细胞，以避免血液中 IgG 对后续实验的影响。组织研磨大部分需要匀浆处理，传统的匀浆方式使用的力度和次数不同，均会影响提取结果，造成人为误差，致使 WB 结果重复性差。（PS：Invent 蛋白提取试剂盒无需匀浆仪，特殊的研磨方式，保证你的重复性，「手残」党也不用怕哈！）
2 关于降解
组织和细胞内常含有内源性蛋白酶，在提取蛋白的过程中，有可能消化目的蛋白，可从以下几个方面可避免蛋白被降解：
1. 加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。（如何选择抑制剂及添加方法点这里）链接：
2. 加快提取速度，避免蛋白降解。
样品制备后
1 浓度检测与评估
蛋白提取完成后，建议用 BCA 法准确测定浓度（BCA 法测浓度操作详解点这里） 以确保上样量清楚可控。
2 制样及样品储存
浓度测定后，建议将样品浓度调整到同一浓度，与 loading buffer 混匀煮沸后，离心后等体积等质量上样。（上样前制样详细说明点这里）
如果一次提取的蛋白用不完，建议制样后分装成小管-80 度储存，下次实验前拿出小管再次煮样使用，避免反复冻融，当然储存时间越长蛋白质量会越差哦！（样品保存还有哪些注意事项点这里）
3 WB 内参
尽管采取了多种方法来保证蛋白提取无失误、浓度相近，但在后续 WB 时仍需检测内参对照，以确保实验的严谨。（WB 内参如何选择点这里）