- 移动端
英文特生物技术（北京）有限公司品牌商
12 年
手机商铺
- NaN
- 0
- 0
- 1
- 0
推荐产品
公司新闻/正文
膜蛋白WB用什么内参？
9814 人阅读发布时间：2024-01-23 15:07
普通蛋白WB检测，我们通常会选择由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)作为内部参照（内参），因为它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时可以用来做参照物。那如果做膜蛋白WB，还可以用管家基因做内参吗？还是一定要用膜蛋白的内参呢？
首先我们先了解一下管家基因内参和膜蛋白内参分别有哪些：
Actin：即肌动蛋白，分子量42kDa，是一类形成微丝的球状多功能蛋白质，基本上存在于所有真核细胞中。哺乳动物至少有6种肌动蛋白异构体由不同的基因编码， 根据它们的等电点分为三类（α， β和γ），一般来说，α肌动蛋白存在于肌肉中（α-骨骼，α-主动脉平滑，α-心脏），而β和γ在非肌肉细胞中很突出（β-细胞质，γ1-细胞质，γ2-肠道平滑）。
Tubulin：即微管蛋白，分子量约55 kDa，微管蛋白是球形分子，有两种类型：α微管蛋白(α-Tubulin)和β微管蛋白(β-Tubulin)。
GAPDH：是糖酵解反应中的一个酶，分子量36kDa。广泛分布于各种组织中的细胞，几乎在所有组织细胞中都高水平表达，在同种细胞或组织中的表达量一般是恒定的，且很少受外部诱导物的影响。但比如缺氧和糖尿病等疾病存在下，会增加 GAPDH 在特定细胞和组织中的表达。
细胞膜专用内参
Na+/K+ ATPase(100KD)：存在于细胞膜中，是对钠和钾两种离子能进行交换的主动运输的酶。1957年由J．C．Skou所发现。除猫、狗等的红细胞膜等少数例外，在动物细胞膜中都存在。可作为经典的细胞膜内参。
图片来源：Yan Zhang, et al (2019).doi.org/10.1038/s41422-019-0184-1
Pan-cadherin(135KD ,Tissue specific express)：钙粘蛋白是钙依赖性细胞粘附蛋白。在连接细胞时，它们优先以亲同的方式与自己相互作用。属于单通道I型膜蛋白。但P-Cadherin 具有一定的组织表达特异性，主要表达于胎盘、间皮组织、上皮细胞等。
图片来源：Cheng, Y, et al (2022).doi.org/10.1016/j.jcmgh.2022.01.017
其他各亚细胞蛋白内参
这么多的内参，到底该如何选择呢？
1. 根据WB实验目的选择
验证膜蛋白位置相关实验：例如验证目的蛋白是否定位或转运至膜上，或者其他组分与膜上蛋白的表达量差异。需先分离出膜蛋白组分（推荐Invent Cat#SM-005），此时需使用膜蛋白专用内参，如Na+/K+ ATPase等确认提取到的组分是膜蛋白，同时还可检测其他非膜蛋白内参作为膜蛋白提取纯度的验证标准。
示例：
图片来源：doi:org/ 10.4049/jimmunol.1400817
Leung等人[1]研究PRL3对ULBP2蛋白转运的影响。人结肠癌细胞系HCT116使用40uM PRL3-I处理后，经过Invent SM-005离心管柱法进行细胞组分分离后，分别对细胞质膜（Mem），细胞器（Org）和细胞浆（Cyto）组分进行WB检测，使用Na+/K+ ATPase作为细胞质膜内参，Tubulin作为胞浆内参，Calnexin作为总膜内参，内参的设置验证了膜蛋白及各组分的分离成功，并具有良好的纯度，组分间无交叉污染，同时说明了PRL3-I处理前后对这些内参蛋白没有影响。从而进一步验证经过PRL3-I处理后抑制了ULBP2的成熟，导致ULBP2蛋白在内质网中的滞留，而无法转运到细胞质膜上的过程。
膜蛋白定性或半定量实验：例如验证样品中膜蛋白是否存在或在药物处理后是否发生量的变化。则可分离全蛋白（推荐Invent Cat#SD-001/SN-002)，使用常见的管家基因做为内参即可。
2. 根据WB实验条件选择
内参蛋白在实验条件下需要保持恒定，要考虑实验中的处理条件是否会影响内参的表达，例如文献中表明使用甲状腺素处理样品会影响经典的Na+/K+ ATPase的表达，这时就需要使用其他膜蛋白专用内参来替代。
3. 根据样品选择
部分样品在细胞膜上也表达Actin, GAPDH和Tubulin等管家基因，也可以作为膜蛋白的内参，但其表达是否稳定，表达量是否足够作为内参，需要进一步确认。特别是验证蛋白位置相关问题时，要考虑是否足够严谨。
4. 其他考虑因素
内参蛋白和目的蛋白相对分子量需要有差异。
目的蛋白是膜蛋白时，要根据实验目的及实验条件选择使用合适的内参。如需验证膜蛋白是否在细胞膜分布或定位，则需要先分离富集膜蛋白，并使用膜蛋白专用内参如Na+/K+ ATPase（Invent Cat # IN-SM005AB）或Pan-cadherin作为内参进行WB验证。如不需验证其分布及定位，仅作为定性或半定量检测，则可以根据目标膜蛋白表达量的多少选择使用总蛋白或富集的膜蛋白作为样品进行WB验证，可使用管家基因作为内参。
参考文献：
【1】Leung W-H. et al.(2015). PRL-3 Mediates the protein Maturation of ULBP2 by regulating the tyrosine phosphorylation of HSP60.The Journal of Immunology.doi:10.4049/jimmunol.1400817.