【实验技巧】WB上样前如何制样---那些年你该学会的实验系列（九）

WB是实验室常见实验之一，蛋白定量后，上样之前，还需要哪些步骤制样呢？

1.蛋白含量测定后，建议把各个样品稀释到某一固定浓度（稀释可使用PBS，水或裂解液），等体积等质量上样，计算上样体积时需包含loading buffer的体积。

例如：把所有蛋白浓度都稀释到2ug/ul，然后与2Xloading buffer 1:1混合后，浓度成为1ug/ul，建议上样20-30ul即可。

2.与loading buffer混匀后，要将样品在沸水中煮3-5分钟，使蛋白充分变性。也可使用PCR仪95°加热5分钟。

PS：煮沸并非必须步骤，有些抗体仅需70℃煮或无需煮沸，具体请参照抗体要求操作。

3.煮沸后在冰上静置少许时间后进行低速离心，即可上样。剩余样品建议分装后保存，样品可以在4℃冰箱短时间保存，也可以在-20或-80℃保存，解冻后可重新煮沸上样。

PS：样品冻存时间过长或反复冻融会使蛋白质的抗原特性改变。

上样之前煮沸的目的是什么？

煮沸样品的目的是为了更好地将蛋白质的高级结构打开。在温度高时，一方面维持蛋白质高级结构的各种作用力减弱，另一方面促进SDS的电荷覆盖和疏水键打开作用。通过上样buffer和加热的处理，蛋白样品呈现带负电荷的长链（还原电泳），在电泳时的分子筛效应使得泳动只和蛋白质大小有关（也就是表观分子量），与蛋白形状无关。

往期精彩回顾