WB实验经常会遇到各种各样的问题，通过解读实验结果，我们可以初步判断出现问题的环节，并分析出问题所在，针对问题进行方案优化和改进即可解决80%以上的WB问题。

      下面我们将一起进行案例解析，分析WB常见问题原因及解决方案！

01   检测出的蛋白分子量与预期分子量不同  

问题描述：比目标蛋白分子量小或者大的位置出现多条条带，检测出的条带大于预期分子量，或小于预期分子量。

可能导致的原因及解决方案：

1.  蛋白存在翻译后修饰：天然蛋白翻译后修饰，如糖基化、磷酸化、羟基化会改变蛋白分子量以及其迁移率。

解决方案：查阅文献是否有多条带报道，如确认是由翻译后修饰造成的，可用合适的试剂处理样品，去除修饰。

2.  目标蛋白形成多聚体：检测出的条带分子量可能是预期条带的2倍或3倍。

 

解决方案：如果是膜蛋白，使用70℃或者更低的温度煮样，避免形成多聚体。煮样时间不低于10分钟，以便让蛋白质解聚。

3.  目标蛋白含有多个异构体或剪切体

解决方案：确认目标蛋白是否有异构体或剪切体，查看抗体是否识别异构体或剪切体。

4.蛋白含有不寻常比例的碱性或酸性氨基酸

基本氨基酸组成将影响蛋白的迁移率；如果蛋白含有大量的碱性氨基酸如赖氨酸、精氨酸、组氨酸（包括组氨酸标签），这类蛋白将表现出比预期的分子量要大:例如溶菌酶，含有多个赖氨酸残基，就比相同分子量的其它蛋白迁移要慢。相反，蛋白含有谷氨酸或天冬氨酸残基时，表面带有净负电荷，将有很快地迁移速度，表现比预期分子量要小。

02   高背景  

问题描述：可以检测到条带，但是除条带外的背景部分也很黑，看上去非常“脏”，信噪比低。

可能导致的原因及解决方案：

1.未进行封闭或封闭不充分：

解决方案：使用合适的封闭试剂，延长封闭时间。

2.一抗浓度过高，导致抗体非特异性结合 解决方案：抗体稀释至合适的浓度，延长孵育时间以增加特异性结合。 3. 二抗与封闭剂非特异性结合 解决方案：设置不加一抗的阴性对照，降低二抗的孵育时间 4.蛋白样品质量差：目标蛋白没有被有效提取出，致使与抗体有效结合的抗原不足，信噪比差（目标条带与背景差别越大就越干净），蛋白样品中含有较多的干扰物，例如核酸，多糖，脂类。使用的蛋白提取裂解液中含有干扰背景的成分。 解决方案：更换蛋白样品制备方案

案例如下图：小鼠心肌组织，分别通过RIPA裂解液（图左）和Invent柱式法肌肉总蛋白提取试剂盒（cat#SA-06-MS）（图右）进行总蛋白提取，经BCA检测后等量上样，进行WB检测，结果可见使用Invent柱式法提取的样品，WB背景更加干净，条带更加清晰漂亮，信噪比高，通过更换蛋白样品提取方法，可以明显看到WB背景得到有效改善。

 

5.洗膜不充分 解决方案：增加漂洗时间和缓冲液体积 6. 曝光时间过长 解决方案：缩短曝光时间 7. 缓冲液污染 解决方案：使用新配制缓冲液

 

03   信号弱或无信号  

问题描述：无法检测出目标条带或条带若隐若现，时有时无

 

可能导致的原因及解决方案：

1.抗原量不足

解决方案：增加上样量（通常建议15-20ug），并增加阳性对照。使用相应刺激增加目标蛋白表达丰度。必要时进行亚细胞结构分离富集目标蛋白后再检测（如分离核蛋白，膜蛋白，线粒体蛋白等）。

2.蛋白质样品质量差，目标蛋白没有被有效提取出或在样品在储存过程中降解。

解决方案：更换蛋白样品制备方案，加入蛋白酶抑制剂防止降解

案例如下图：分别使用RIPA裂解液和Invent柱式法总蛋白提取试剂盒（cat#SD-001/SN-002）提取小鼠心肌组织总蛋白，30ug，60ug，90ug梯度上样，检测结果显示，低分子量Histone H3（15KD）检出有明显差异，柱式法提取可以更有效的提取低分子量蛋白，避免蛋白丢失问题，提高蛋白样品质量。

3.膜的错误选择

解决方案：选择合适孔径的膜：

目标蛋白大于22kDa蛋白选用0.45μm孔径，小于22kDa蛋白选用0.22μm孔径。

4.转膜时间太短导致目标蛋白没有充分转移到膜上，或者转膜时间过长导致样品转穿

解决方案：转膜后确定转膜效率、保证胶与膜充分结合、保证电极正确装配、控制转膜温度（冰袋降温）、优化转膜电流及时间

5.一抗二抗不匹配

解决方案：二抗需和一抗宿主的物种相同

 

04   非特异性条带

问题描述：除目标条带外，其他分子量上也有很多条带

可能导致的原因及解决方案：

1.底物过于灵敏

解决方案：选择合适的底物

2.交叉反应

解决方案：选择单克隆抗体

3.一抗，二抗浓度过高，产生非特异性结合

解决方案：抗体稀释至合适的浓度

4.抗体特异性差

解决方案：选择合适的抗体产品

5.曝光时间太长

解决方案：减少曝光时间